Artikel ini mengusulkan teknologi chip mikrofluida baru untuk deteksi multipleks mikroorganisme patogen udang. Tim peneliti terintegrasi multi-enzim isoterme isotermal rapid nucleic acid acid acid (MIRA) teknologi dan metode deteksi fluoresensi real-time. Chip mikrofluida ini memberikan solusi yang cepat, sensitif dan efisien untuk deteksi patogen udang utama di tempat.
Latar belakang penelitian dan signifikansi
Industri pertanian udang global adalah salah satu komponen ekonomi terpenting dalam budidaya, tetapi industri ini telah lama menghadapi ancaman dari berbagai mikroorganisme patogen. Patogen-patogen ini sering menyebabkan kematian udang skala besar, secara serius mempengaruhi produksi dan manfaat ekonomi. Termasuk penyakit nekrosis hepatopancreatic akut (AHPND), virus sindrom spot putih (WSSV), virus hipodermal dan hematopoietik nekrosis yang menular (IHHNV), udang hemosit iridovirus (Shiv), dan enterohepaticus (EHP), virus, dll. Virus.
Metode deteksi patogen tradisional, seperti reaksi berantai polimerase (teknologi PCR), memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi, tetapi kompleks untuk beroperasi, membutuhkan waktu lama, dan bergantung pada peralatan laboratorium. Keterbatasan ini membuat teknologi PCR tidak cocok untuk pengujian di tempat yang cepat. Teknologi MIRA telah menjadi alat deteksi molekuler yang cocok untuk aplikasi di tempat karena karakteristik amplifikasi yang cepat di bawah suhu konstan dan suhu normal.
Prinsip Teknologi Mira
Teknologi amplifikasi asam nukleat cepat multi-enzim multi-enzim (teknologi MIRA) adalah teknologi amplifikasi suhu konstan yang bergantung pada sinergi protein fungsional berganda pada suhu kamar untuk mencapai amplifikasi asam nukleat yang cepat. Ini adalah teknologi deteksi asam nukleat cepat di tempat yang benar-benar portabel. Dibandingkan dengan PCR, Mira memiliki lebih banyak keunggulan.
Desain dan inovasi chip mikrofluida
Diagram skematik platform deteksi RPA pada chip untuk beberapa mikroorganisme patogen udang penting
(A) Struktur chip mikrofluida tipe disk. 1: Ruang Reaksi; 2: katup bola; 3: port knalpot; 4: port pengambilan sampel;
(B) Tampilan yang meledak. 5: Film Penyegelan Panas; 6: Substrat chip.
(C) Tata letak terperinci dari enam set primer di dalam sektor ini. Setiap set primer pra-tetap di ruang reaksi yang ditunjuk.
(D) Prosedur operasi lengkap platform deteksi RPA Chip.
Artikel ini mengusulkan chip mikrofluida yang terintegrasi dengan teknologi MIRA untuk deteksi multipleks mikroorganisme patogen udang. Teknologi mikrofluida dapat mengontrol cairan dalam saluran tingkat mikron untuk manipulasi yang tepat, sehingga mencapai deteksi multi-target yang efisien dan berbiaya rendah.
Chip ini memiliki fitur desain utama berikut:
● Chip mikrofluida sentrifugal
Chip mengadopsi desain drive sentrifugal, menggunakan gaya sentrifugal untuk mendistribusikan sampel secara merata ke dalam setiap ruang reaksi. Desain ini menyederhanakan proses operasi, dan operator dapat menyelesaikan seluruh reaksi dengan hanya menyuntikkan sampel.
● Deteksi multi-target
Chip ini telah ditanamkan sebelumnya dengan tipe bakteri yang perlu dideteksi: nekrosis hepatopancreatic akut (V-AHPND), virus sindrom spot putih (WSSV), virus nekrosis subkutan (Ihhnep) yang menular. ) Probe primer untuk lima patogen. Desain ini secara bersamaan dapat mendeteksi enam target gen dalam satu reaksi, memungkinkan penyaringan cepat beberapa patogen.
● Deteksi fluoresensi real-time
Reaksi amplifikasi teknologi MIRA dalam chip dikombinasikan dengan probe fluoresen, yang dapat memantau kemajuan reaksi amplifikasi secara real time. Desain probe memungkinkan sinyal fluoresen dilepaskan hanya ketika produk amplifikasi dihasilkan, sehingga mencapai deteksi kuantitatif yang cepat dan sensitif.
● Sistem reaksi konsentrasi rendah
Setiap unit reaksi chip hanya membutuhkan volume reaksi 5 μL, yang sangat mengurangi konsumsi reagen. Ketika seluruh sistem berjalan, hingga empat sampel dapat diproses secara bersamaan, dan setiap sampel dapat mendeteksi lima patogen, sangat meningkatkan efisiensi deteksi.
Sensitivitas, spesifisitas, dan pengulangan
Kinerja sistem chip termasuk deteksi simetri, resonansi dan pengulangan.
● Sensitivitas
Hasil eksperimen menunjukkan bahwa chip dapat mendeteksi angka salinan gen target serendah 10 salinan/μL, dengan sensitivitas yang sebanding atau bahkan lebih tinggi dari metode PCR tradisional. Sensitivitas yang tinggi ini memastikan bahwa teknologi dapat mendeteksi individu yang terinfeksi awal dalam aplikasi praktis, sehingga memungkinkan penyaringan patogen awal.
● Spesifisitas
Eksperimen yang melakukan tes reaksi silang pada berbagai patogen non-target, dan hasilnya menunjukkan bahwa chip sangat spesifik untuk patogen target dan dapat secara akurat membedakan berbagai jenis patogen. Semua tes untuk penyakit nekrosis hepatopancreatic akut (V-AHPND), virus sindrom spot putih (WSSV), hipodermal infeksius dan virus nekrosis hematopoietik (IHHNV) yang tidak ada pada hemacytic virus yang tidak ada udang (syair) dan entero-ra-ra-ra-ra-ra-ra-ra-rackatitis yang tidak memiliki hipaticic, amplifikasi non-spesifik.
● Pengulangan
Untuk mengevaluasi stabilitas metode ini, tim peneliti melakukan beberapa percobaan berulang. Hasil penelitian menunjukkan bahwa koefisien variasi (nilai CV) antara berbagai percobaan kurang dari 10%, menunjukkan pengulangan dan konsistensi eksperimental yang baik.
Aplikasi dan keuntungan lapangan
Desain chip mikrofluida teknologi MIRA memberikan keuntungan aplikasi lapangan yang signifikan, terutama cocok untuk deteksi cepat dan pemantauan patogen dalam pertanian udang:
● Proses operasi yang nyaman
Seluruh proses deteksi hanya membutuhkan menyuntikkan sampel ke dalam chip dan memulai perangkat reaksi. Hampir tidak memerlukan operasi manual dan cocok untuk digunakan non-profesional di lokasi.
● Kemampuan respons yang cepat
Sistem ini dapat memperoleh hasil tes dalam waktu 20 menit, sangat memperpendek waktu tes. Ini sangat penting untuk respons penyakit yang cepat di pertanian dan mengurangi penyebaran patogen.
● Kemampuan deteksi multipleks
Lima patogen utama dapat diidentifikasi dalam satu tes, yang sangat meningkatkan efisiensi deteksi dan menghemat biaya dan waktu deteksi.
Prospek Teknologi Mira
Meskipun teknologi PCR telah lama dinilai sebagai standar emas untuk deteksi amplifikasi asam nukleat, teknologi MIRA telah menunjukkan potensi aplikasi yang hebat karena reaksi cepatnya pada suhu konstan, operasi sederhana, dan persyaratan peralatan rendah. Dengan membandingkan dengan PCR yang dikombinasikan dengan sekuensing DNA, ditemukan bahwa hasil deteksi chip amplifikasi isotermal konsisten dengan hasil PCR dalam hal sensitivitas dan spesifisitas, dan waktu reaksi teknologi MIRA secara signifikan dipersingkat. Oleh karena itu, chip mikrofluida teknologi MIRA dianggap sebagai teknologi yang lebih cocok untuk aplikasi lapangan, terutama di lingkungan yang membutuhkan deteksi patogen berskala cepat dan besar.
Chip mikrofluida berdasarkan teknologi multi-enzim isotermal isotermal nukleat asam nukleat (MIRA) teknologi menyediakan alat yang efektif untuk mendeteksi mikroorganisme patogenik dalam pertanian udang. Teknologi ini memiliki keunggulan sensitivitas tinggi, spesifisitas yang baik, operasi yang mudah, dan kecepatan deteksi cepat, dan memiliki prospek aplikasi yang luas dalam pencegahan dan kontrol penyakit akuakultur. Dengan pengembangan lebih lanjut dan optimalisasi teknologi, sistem ini diharapkan diterapkan pada deteksi patogen yang lebih akuatik, memungkinkan pencegahan dan pemantauan penyakit yang lebih luas.
Hasil penelitian ini memberikan metode deteksi dini yang andal untuk industri akuakultur, yang secara efektif dapat mengurangi risiko wabah penyakit, meningkatkan efisiensi produksi dan output pertanian, dan meletakkan dasar teknis untuk pengembangan berkelanjutan industri akuakultur.