《Pengembangan novel cas13a/cas12a-mediatedDual "One-Pot" Uji deteksi untuk tanaman yang dimodifikasi secara genetik ekspres
Tanaman yang dimodifikasi secara genetik telah ditanam secara luas di seluruh dunia, dan banyak negara secara bertahap meningkatkan langkah -langkah pengaturan mereka untuk memastikan keamanan tanaman yang dimodifikasi secara genetik. Pengembangan metode deteksi genetik di tempat yang cepat dan akurat sangat penting untuk pertanian dan biosafety, dan dapat mengurangi kekhawatiran publik tentang produk yang dimodifikasi secara genetik.
Dalam penelitian ini, kelompok penelitian mengembangkan reaksi satu pot baru -- deteksi ganda MIRA dikombinasikan dengan CRISPR ganda (metode MR-DCA) untuk deteksi simultan CAMV35S dan target genetik NOS dalam tanaman yang dimodifikasi secara genetik, memberikan metode deteksi yang sederhana dan efisien untuk deteksi tanaman genetika.
Metode eksperimental
Produk ganda MIRA dianalisis oleh Sistem Ganda CAS13A dan CAS12A untuk menghasilkan dua sinyal independen yang tidak saling mengganggu, dan kemudian warna fluorescent dibaca oleh instrumen iluminasi atau dengan strip uji dengan dua baris T untuk mencapai pembacaan saluran ganda. Seluruh proses selesai dalam waktu kurang dari 35 menit, dengan batas deteksi serendah 20 eksemplar.
(Prinsip Deteksi MR-DCA CAMV35S dan NOS)
Seluruh percobaan dibagi menjadi tiga langkah: amplifikasi MIRA, reaksi CRISPR, dan dua metode interpretasi hasil.
Gen CAMV35S digunakan sebagai target CAS13A, dan gen NOS digunakan sebagai target CAS12A. Dua pasang primer Mira dirancang masing -masing. Sistem CAS13A hanya mengenali RNA, sehingga wilayah primer maju dirancang, yang berisi promotor T7 untuk transkripsi dan aktivasi CAS13A berikutnya. Pam ditambahkan ke gen NOS. Penambahan di atas memastikan bahwa protein CAS13A dan CAS12A dapat berikatan dengan CrRNA masing-masing, dan tidak ada gangguan atau reaksi silang antara kedua sistem.
Situasi eksperimental
Sensitivitas dan spesifisitas
Sampel diencerkan dalam gradien untuk menguji intensitas fluoresensi reaksi MIRA. Ditemukan bahwa intensitas fluoresensi masih dapat dideteksi pada konsentrasi sampel 20 μL. Konsentrasi 20 μL akhirnya dipilih untuk percobaan.
(Konsentrasi sampel yang berbeda dan strip uji digunakan untuk pengembangan warna dan perhitungan kuantifikasi intensitas)
Untuk lebih mengevaluasi spesifisitas MR-DCA, tim peneliti menguji sampel campuran hewan non-transgenik dan tanaman non-transgenik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa hanya sampel transgenik yang mengandung CAMV35S dan NOS memiliki sinyal fluoresensi yang tinggi, sedangkan intensitas fluoresensi sampel lain dekat dengan kontrol negatif. MR-DCA dapat digunakan sebagai platform deteksi asam nukleat dual-target tertentu.
24 Sampel tanaman diuji oleh MR-DCA. Di antara mereka, 1, 2, 15, 16, 21, dan 22 adalah jagung transgenik yang mengandung promotor CAMV35S. 7, 8, 23, dan 24 adalah beras transgenik yang resistan terhadap penyakit yang mengandung NOS Terminator. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17, dan 18 adalah kedelai transgenik yang mengandung promotor CAMV35S dan NOS Terminator.
(Hasil tes dari 24 sampel)
Reaksi cepat
Waktu reaksi adalah faktor penting dalam deteksi di tempat. Tim peneliti mengamati bahwa sinyal fluoresensi FAM dan HEX dapat dideteksi dengan instrumen fluoresensi ketika waktu reaksi adalah 10 menit. Mira dikombinasikan dengan reaksi CRISPR juga mengamati fluoresensi kuning setelah 15 menit.
(Sinyal fluoresensi pada waktu reaksi MIRA yang berbeda)
(Pengembangan warna strip uji pada waktu reaksi MIRA yang berbeda dan perhitungan kuantifikasi intensitas)
Kesimpulan Eksperimental
Hasil eksperimen menunjukkan bahwa Dual MIRA memiliki spesifisitas yang baik dan dapat secara akurat mendapatkan produk amplifikasi CAMV35S dan NOS. Sistem CAS13A dan CAS12A bereaksi secara mandiri tanpa saling mengganggu. Tes MR-DCA dapat secara akurat mendeteksi 20 salinan pada suhu rendah 35 menit, yang memiliki nilai besar dalam mendeteksi tanaman yang dimodifikasi secara genetik di lapangan.
Informasi artikel
Nama Jurnal: 《Jurnal Penelitian Lanjutan Express
Judul Artikel: 《Pengembangan uji deteksi ganda CAS13A/CAS12A yang dimediasi "satu pot" untuk tanaman yang dimodifikasi secara genetik Express
Faktor Dampak: 11.4
Tim Peneliti: Wang Xiaofu, Akademi Ilmu Pertanian Zhejiang