Deteksi chaphamaparvovirus kucing yang terlihat dan cepat menggunakan amplifikasi cepat isotermal multienzim dan uji dipstick aliran lateral
Jurnal:Perbatasan dalam Mikrobiologi Seluler dan Infeksi
Faktor Dampak:4.6
Chaphamaparvovirus pada kucing(FeChPV)adalah parvovirus baru, pertama kali terdeteksi pada kucing diare di Kanada pada tahun 2019. Patogenisitas dan karakteristik molekulernya masih belum jelas, serta menunjukkan keragaman inang dan genetik, sehingga memerlukan penyelidikan epidemiologi lebih lanjut. Saat ini, belum ada metode standar untuk mendeteksi FeChPV.
Metode amplifikasi cepat isotermal multienzim-dipstick aliran lateral (MIRA-LFD)telah berhasil digunakan untuk mendeteksi berbagai virus, menawarkan keunggulan seperti kecepatan, kesederhanaan, dan tidak memerlukan instrumen yang presisi. Tim peneliti membuat metode MIRA-LFD yang cocok untuk FeChPV guna mengatasi tantangan dalam deteksi klinis akar rumput. Tanpa bergantung pada instrumen presisi,metode MIRA-LFD menyelesaikan deteksi FeChPV pada suhu 37 derajat dalam waktu 20 menit dan tidak menunjukkan reaktivitas-silang dengan virus lain. Batas deteksi adalah 32,3 salinan/μL,10 kali lebih tinggi dibandingkan metode PCR. Selain itu, metode MIRA-LFD mendeteksi 29 sampel positif FeChPV-di antara 417 kucing diare, dengan tingkat kepositifan sedikit lebih tinggi dibandingkan metode PCR bersarang. Hasil ini menunjukkan bahwa metode MIRA-LFD yang sudah ada untuk mendeteksi FeChPV adalah metode yang efisien, ekonomis, andal, dan sederhana, berkontribusi terhadap pencegahan dini dan pengendalian infeksi FeChPV.
1.Metode Eksperimental
Sampel Klinis:Sampel usap rektal yang digunakan dalam penelitian ini dikumpulkan dari 632 kucing (termasuk 417 kucing yang menderita diare dan 115 kucing sehat) dan 474 anjing (termasuk 342 kucing yang menderita diare dan 132 anjing sehat) di klinik hewan di provinsi Guangdong, Henan, Anhui, Zhejiang, dan Daerah Otonomi Mongolia Dalam antara tahun 2022 dan 2024.
Amplifikasi Asam Nukleat:Asam nukleat DNA yang diekstraksi ditambahkan ke sistem MIRA. Rekombinase dan primer membentuk kompleks; dengan bantuan protein tambahan dan protein pengikat-untai tunggal, mereka menginvasi templat DNA-untai ganda. Primer terikat pada daerah komplementer homolog untuk membentuk daerah D-loop, sedangkan rekombinase dibongkar dari kompleksnya. Polimerase terikat pada ujung 3' primer dan memulai sintesis DNA, secara eksponensial memperkuat wilayah target pada cetakan. Proses ini berputar dengan cepat dan efisien, sehingga mencapai amplifikasi fragmen target yang sangat cepat hanya dalam 15 menit.
Pengembangan Warna Strip Tes:Produk amplifikasi asam nukleat diencerkan 1:10, diaplikasikan pada strip uji, dan hasilnya dibaca setelah 5 menit.
Seluruh proses mulai dari amplifikasi asam nukleat hingga pengembangan warna strip uji hanya membutuhkan waktu 20 menit.
Amp-Produk biologi masa depan digunakan dalam eksperimen:
Dalam studi tersebut, empat rangkaian kombinasi pemeriksaan primer-spesifik yang dirancang telah disaring. Elektroforesis gel agarosa dan strip uji asam nukleat digunakan untuk presentasi hasil. Keempat kombinasi pemeriksaan primer-dapat mendeteksi virus FeChPV. Berdasarkan hasil elektroforesis gel agarosa, kombinasi FeChPV-4 menunjukkan pita target paling terang, sehingga kombinasi inilah yang dipilih untuk pengujian selanjutnya.
Berdasarkan hasil elektroforesis gel agarosa, amplifikasi selama 5, 10, 15, dan 20 menit semuanya menghasilkan pita target. Intensitas pita target mencapai puncaknya pada amplifikasi 15 menit, menjadikan 15 menit sebagai waktu reaksi optimal untuk pengujian ini. Amplifikasi pada 36 derajat, 37 derajat, 38 derajat, 39 derajat, dan 40 derajat semuanya menghasilkan pita target, dengan pita paling terang diamati pada 39 derajat, menjadikan 39 derajat sebagai suhu reaksi optimal untuk pengujian ini.
(Gambar A: 1: Amplifikasi 5 menit; 2: Amplifikasi 10 menit; 3: Amplifikasi 15 menit; 4: Amplifikasi 20 menit) (Gambar B: 1: Amplifikasi 36 derajat; 2: Amplifikasi 37 derajat; 3: Amplifikasi 38 derajat; 4: Amplifikasi 39 derajat; 5: Amplifikasi 40 derajat)
2. Kinerja Deteksi
Kepekaan:
(Gambar A: Hasil MIRA disajikan menggunakan elektroforesis gel agarosa)
(Gambar B: Hasil Nested PCR disajikan menggunakan elektroforesis gel agarosa)
(Gambar C: Hasil MIRA disajikan menggunakan strip tes asam nukleat)
Sampel dilakukan pengenceran serial 10 kali lipat mulai dari 3,23×10⁶ salinan/μL. PCR bersarang dengan elektroforesis gel agarosa dapat mendeteksi secara stabil 3,23×10² salinan/μL; MIRA dengan elektroforesis gel agarosa dan MIRA dengan strip uji asam nukleat keduanya dapat mendeteksi 3,23×10¹ salinan/μL secara stabil.
Metode MIRA menunjukkan sensitivitas yang konsisten dengan menggunakan dua format penyajian hasil yang berbeda, dan sensitivitas metode MIRA lebih unggul dibandingkan dengan nested PCR.
Kekhususan:
(1: FeChPV, feline chaphamaparvovirus; 2: FPV, feline panleukopenia virus; 3: FeAstV, feline astrovirus; 4: FBoV, feline bocavirus; 5: CachaV, canine chaparvovirus; 6: kontrol negatif)
Metode MIRA-LFD yang baru dibuat hanya mendeteksi FeChPV dan tidak menunjukkan reaktivitas-silang dengan virus referensi lain, sehingga menunjukkan spesifisitas yang baik.
3.Ringkasan Studi
Studi ini menetapkan metode MIRA-LFD untuk mendeteksi FeChPV tanpa memerlukan instrumen-presisi tinggi. Sebagai metode deteksi yang efisien, ekonomis, dan andal dengan sensitivitas dan spesifisitas tinggi, metode MIRA-LFD lebih cocok untuk deteksi klinis, memberikan dukungan teknis untuk pencegahan dini dan pengendalian infeksi FeChPV.
4.AMP-BIOTEKNOLOGI MASA DEPAN
Amplifikasi asam nukleat cepat isotermal multienzim MIRA adalah teknologi yang benar-benar memungkinkan deteksi cepat di lokasi.
Teknologi MIRA didasarkan pada mekanisme perbaikan rekombinasi gen in vivo, mengandalkan aksi sinergis beberapa protein fungsional pada suhu kamar untuk mencapai amplifikasi asam nukleat yang cepat (5-20 menit), sensitif, spesifik, dan aman pada suhu kamar (25 derajat –45 derajat ). Karena sifat teknologi MIRA yang isotermal, teknologi MIRA memiliki persyaratan peralatan yang rendah dan pengoperasian yang sederhana. Melalui perangkat portabel yang diperkecil, hal ini dapat diterapkan dalam pengujian garis depan di berbagai skenario aplikasi, menghadirkan pengujian asam nukleat yang cepat dan akurat ke berbagai situasi seperti POCT, pengujian di rumah, bidang pertanian, dan-penegakan hukum di lokasi. Berdasarkan teknologi MIRA, Amp-future Biotech telah mengembangkan serangkaian-produk pengujian cepat di lokasi, termasuk bahan pelepas asam nukleat cepat, reagen amplifikasi asam nukleat cepat isotermal, strip uji emas koloidal, dan peralatan portabel mini, sehingga menciptakan solusi keseluruhan untuk pengujian molekuler cepat-di lokasi. Selain itu, teknologi MIRA Amp-future menawarkan keunggulan aplikasi bila dikombinasikan dengan teknologi CRISPR, NGS, SNP, mikrofluida, dan banyak lagi.
Selain rangkaian-produk pengujian cepat di lokasi yang ditunjukkan di atas, Amp-future Biotech juga menyediakan:
Reagen Penelitian:Menyediakan bahan baku reagen dan dukungan teknis untuk penelitian ilmiah dasar, serta referensi literatur proyek.
Produksi OEM:Mampu secara mandiri menghasilkan produk akhir-kemurnian tinggi, aktivitas-tinggi di seluruh proses, mencapai produksi-skala industri.
Pengembangan Proyek yang Ditugaskan:Informasi urutan dan hasil analisis penyelarasan urutan, desain dan sintesis probe primer-proyek, sintesis dan sampel plasmid proyek, laporan dan hasil proyek, dll.
Untuk informasi lebih lanjut, selamat datang untuk bertanya.